全基因组测序(WGS)是食品安全领域的新流行语之一。华体会重庆时时彩本文简要回顾了WGS是什么,以及近年来它是如何彻底改变食品安全的。华体会重庆时时彩它现在已经成为公共卫生监测的一个组成部分,并越来越多地被美国和国外的食品工业用于研究食源性细菌病原体、指示物和腐败微生物,以及抗菌素耐药性的传播、毒性等。食品安全领域的华体会重庆时时彩WGS特别关注细菌(本文的主题),但它同样适用于病毒和寄生虫。

一点背景

WGS决定了一个细胞的全部遗传组成——“基因组”,它包括染色体和染色体外元素,如质粒。两者都是环状结构,但是染色体要比质粒大得多[1-6百万对DNA碱基对(bp)](约500 -几十万bp)。多年来,人们只能对长达几千bp的DNA片段进行测序,但在2000年左右,通过多次对小的、重叠的随机片段(约25 -几千bp)进行一次反应(大规模平行测序),就可以确定整个基因组序列。这些数以百万计的重叠序列可以像拼图一样排列在一起,因此,从理论上讲,建立了基因组的完整连续序列。这一组装是使用特殊的生物信息学软件以电子方式完成的。其他生物信息学软件可以用来比较来自不同细菌的组合序列。该生物信息学软件可以在公共领域的网上免费获得,也可以在商业软件包中获得。商业软件通常比开源软件更友好,但价格昂贵。如果分析可以由现有人员完成,而不需要雇用生物信息学家,软件的成本就可以收回。实际的测序反应称为下一代测序(NGS),整个测序、组装和分析过程称为WGS。

WGS方法

实际上,有两种类型的NGS存在:短读测序和长读测序,有时也称为第二代和第三代测序,每种测序都有几个变体。短读测序仪具有很高的准确性,但正如其名称所暗示的那样,所生成的每个序列长度(一个“读”)都很短,通常为50-500 bp。利用短读技术,几乎不可能完全组装一个基因组(“关闭基因组”),因为基因组包含的重复序列区域不能用短读来解析。长链测序仪的准确性较低,但可以产生更长的序列(约1,000-100,000 bp),因此通常可以用该技术关闭基因组。一个封闭基因组的序列通常可以通过纠正由长读技术产生的一个封闭基因组的错误,将可靠的短读序列映射到它。制造商生产多种型号,以适应几乎任何实验室的需要,从手持定序器,可用于现场调查桌面模型,大房间尺寸的定序器。音序器的成本从1000美元的手持式音序器到几十万美元的最大型号。一台小型台式机的售价约为2万美元。测序的成本从50美元到超过1000美元每个样本,取决于测序器和样品的批。

很明显,对于像WGS这样复杂的工作流,很多事情都可能出错;因此,整个过程的质量控制对于确保生成可靠的数据和分析至关重要。

WGS应用程序

WGS在很多方面都很强大。它是区分不同菌株的最终工具,用于监测、跟踪暴发/污染源或传播途径。表型性状如抗菌素耐药性、毒力和血清型可从WGS预测。作为一种监控工具,WGS比其他任何现有方法都更具歧视性。在公共卫生领域,该技术在过去十年中得到了越来越多的应用,2019年在美国,该技术取代了脉冲场凝胶电泳(PFGE)等老的高分辨力方法来检测和调查食源性疾病的暴发。因为它比PFGE更具歧视性,所以可以更快地检测到更多的疾病暴发(通常是在它们很小的时候),并且可以调查和解决更多的疾病暴发。尽管成本相当高,但该方法具有成本效益,因为它还取代了其他常规菌株特征,如血清分型、抗菌素耐药性或毒力测试。在最近对欧洲和美国公共卫生实验室进行的一项案例研究中,据估计,如果平均0.7%的报告病例能够得到预防,那么在国家沙门氏菌病监测中实施全球环境监测系统将获得回报。1

为了监测目的比较分离株的序列时,使用两种根本不同的方法。对序列进行查询,包括DNA碱基水平的突变(单核苷酸多态性- snps)或基因中的任何序列变异(核心基因组多位点序列分型- cgmlst)。这两种方法具有同等的区别性和互补性,这就是为什么在疫情调查中两种方法都被用来确认彼此的结果。SNP方法很难在实验室之间标准化,而cgMLST方法可以通过使用通用数据库进行标准化。因此,SNP最适合集中监测,由一个中心实验室进行所有分析。另一方面,cgMLST更适合于许多实验室网络中的分散监测,就像PulseNet(美国食源性感染监测分子分型网络)今天所做的那样。2两种方法对分离株的序列进行两两比较,将其相似性用系统发育树表示,系统发育树表示分离株之间的进化距离。疾病爆发出现在树叶子附近的聚集隔离物,与树其他地方的其他隔离物明显分离(图1).通常不可能通过查看树来判断它是基于SNP还是cgMLST分析。WGS具有很强的差异性,几乎没有两个序列是100%相同的,因此与疫情相关的分离株通常会显示出一些差异,通常多达5-10个snp或基因变异(cgMLST中的“等位基因”),但根据涉及的生物体和疫情环境会有很大的变异。例如,由沙门氏菌肠炎通常表现出很少的变异(多达2-3个snp /等位基因差异),而暴发由S.鼠伤寒典型表现为5-10 SNP/等位基因差异范围内的变异。2,3在单一事件中,如单批食品中,由单一来源的受污染食品导致的点源暴发中,差异范围如此之小是很典型的。在人畜共患疾病暴发中,可观察到多达50个snp /等位基因的变异,其中感染通过与动物接触传播或由人与人之间传播引起的暴发。4.由于受污染的食品从源头长时间释放而导致的持续暴发,例如在生产过程中产生的常驻菌株的生产工厂,也往往显示与暴发相关的分离菌株之间存在重大差异。

然而,常驻毒株并不总是在生产环境中迅速进化,而且有一些疫情毒株在多年来几乎没有进化。因此,不可能确定确定所有疫情的标准。然而,可以为几乎任何疾病爆发定义纳入标准。为了检测疫情,公共卫生科学家通常寻找5-10 SNP/等位基因范围内彼此不同的分离株簇,这些分离株与所有其他分离株明显分离。随着调查的进行,将确定唯一定义该疫情的阈值。必须始终记住,在疫情调查中,分离株之间的遗传相似性(一种生物学测量方法)是流行病学关系的不完善的替代品,因此,单靠序列分析不能解决疫情。食物和临床孤立之间的WGS匹配不能单独证明食物导致患者的疾病。在采取管制行动之前,必须进行流行病学和/或追溯和环境调查,以解决爆发。同样重要的是要记住,在任何食物来源中都可以在没有发现暴发菌株的情况下解决暴发。在点源暴发中,暴发菌株从生产环境中消失并不罕见,当确定来源时,涉及批次的食物没有残留。


在公共卫生

WGS扩大了公共卫生机构反应的爆发信号。将食物分离物与少数临床分离物匹配并未罕见地识别检测到爆发的源。这种“回顾性”或“车辆驱动的”疫情调查已经变得更加常见。2在过去使用PFGE时,对一种食物分离物和少数病人分离物之间的联系进行流行病学随访,通常证明两者之间的联系是错误的。与PFGE相比,WGS的高特异性改变了这一点。然而,即使使用WGS,这样的链接也不例外。如前所述,在食物和病人中发现相同的菌株意味着他们有共同的祖先。在流行病学上,它们可能是不相关的,因为它们属于同一个祖先的不同的分化/分布链。WGS改变疫情调查的另一种方式是,现在可以识别每年发生少量病例的持续性疫情,即“低和慢”疫情。4.这些疫情是真实发生的,调查和解决它们非常重要,因为与任何疫情一样,我们可以从中吸取重要的粮食生产教训。

疫情数据的解释是一项专家任务,需要仔细考虑来自WGS、流行病学、追溯和环境调查的所有可用信息。

除了爆发调查外,常规测序所有患者患者的食物丧失病原体提供公共卫生科学家,提供其他重要信息。由于隔离物的抗微生物抗性可以通过WG预测,因此我们现在可以获得有关在公共卫生实验室中调查的所有分离物的信息,因此不仅可以快速识别患者和全球食物来源的新出现抗性特征,而且还增加了抵抗监测的新细节水平。对例如青霉素和头孢菌素的抵抗力可能是由于许多不同的机制引起的,其中一些可以在生物之间转移;导致电阻和是否可转移的确切机制可以从WG预测。类似地,有关毒力基因的信息可以帮助科学家们在临床上可识别之前认识到毒性菌株的扩散。我们对特殊菌株毒性的知识不完全理解。关于食品毒性细菌潜在毒力基因的含量的了解将在未来几年内揭示。通过比较来自食品,饲料和生产环境的分离物序列,可以鉴定遗传标记,例如系统发育谱系,SNP,基因和基因功能,这些功能是针对不同食品商品的特异性。可以将该信息与人分离株的序列进行比较,从而识别食品 - 商品水平(“微生物归因”)的散发性感染的主要来源。 This is a powerful tool that is increasingly used to identify intervention areas in food production that most likely will drive down the incidence of foodborne illness.


在食品厂

在食品行业中,WGS目前首先被用作准确追踪食品生产中病原体和腐败微生物的引入和传播链的工具。当用于生产监测时,它也是一个强大的工具,可以确定持续的污染是持续独立的零星引入(分离株有不同的WGS谱)的结果,还是在生产中再次引入或持续一个菌株(分离株显示很少的WGS变异)。这类信息对于确定和评估粮食生产中的微生物质量问题、指导其缓解并记录其影响至关重要。这将反过来为个别制造商生产更安全的食品,如果信息被更广泛地分享,也将为整个行业。

WGS还可以预测与生产环境中病原体和腐败微生物的适应和生存有关的信息,包括它们对杀菌剂和金属的抗性。这些信息还可以指导行业和监管机构采取食品安全干预措施。华体会重庆时时彩

WGS是食品制造商必须清除其产品成为爆发原因的最有力工具之一。如果作为食品安全管理方案的一部分使用,由于华体会重庆时时彩WGS方法比旧方法具有更高的特异性,如果在其场所或产品中没有发现暴发WGS资料,则会令人置信地排除生产商作为暴发源。

我们现在在哪里

WGS现在由美国公共卫生和食品安全当局实施,并在全球许多工业化国家实施。华体会重庆时时彩食品行业也越来越多地使用,即使只有几家大公司建立了完整的序列和分析基础设施。然而,较小的生产者也可以以成本效率的方式使用该技术。

根据他们的需要,可以使用小型测序器在较低的能力水平上建立WGS活动;通过快速的互联网连接,数据可以通过商业应用程序或公共领域的免费软件进行分析,而生物信息学专业知识很少。这些活动也可以全部或部分外包给商业伙伴。私人合作伙伴只能将他们获得的分离株序列与他们拥有的其他分离株序列以及公共领域的分离株序列进行比较,即国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)的GenomeTrakr数据库。2,3然而,美国有两项针对该行业的举措可提供有关行业隔离与历史或正在进行的潜在爆发调查的关系的信息。由伊利诺伊理工学院主办的食品安全与健华体会重庆时时彩康研究所的高通量测序倡议和由佐治亚大学食品安全中心主办的志愿网,为食品行业提供最先进的测序和分析服务。这两项举措都有来自行业和联邦食品安全合作伙伴的顾问委员会;华体会重庆时时彩然而,这两家公司在没有获得特定许可的情况下,都不会与联邦合作伙伴共享行业数据。“自愿网络”可直接访问PulseNet数据库,并可使用PulseNet合作伙伴可获得的所有工具,包括隔离关于正在进行的、尚未向公众提供的疫情调查序列的特定级别信息。

WGS的一个主要缺点是它是在培养生物上进行的。诊断越来越多地使用不需要培养的分子方法,而且将来可用于测序的菌株将会更少。因此,在不通过对标本中所有DNA进行测序而获得分离级数据(“宏基因组学”)方面正在取得进展。3.这项工作尚处于起步阶段,但作为一种工具,它不仅有希望取代基于分离的测序,而且还可以通过收集人类、动物、饲料、食物和环境中的微生物种群信息来证明食物的真实性和有害污染物的存在。

参考文献

  1. https://www.eurosurveillance.org/content/10.2807/1560-7917.ES.2021.26.9.1900606
  2. Brown, E,等人2019。全基因组测序在美国食品安全和公共卫生中的应用华体会重庆时时彩食源性Pathogdis16(7):441-450。
  3. Jagadeesan, B,等人2019年。“下一代测序技术用于改善食品安全:转化为实践。”华体会重庆时时彩食物微生物79: 96 - 115。
  4. Gerner-Smidt,P.等人。“全基因组测序:促进食源性疾病的一次健康监测。”前面的公共卫生7: 172。

Peter Gerner-Smidt,医学博士,科学博士。他是食品安全方面的公共卫生专家。华体会重庆时时彩他曾担任美国疾病控制和预防中心肠道疾病实验室分部和脉冲网络的负责人。